Articolo Completo-Il recettore del Gabapentin α2δ-1 è il recettore neuronale della trombospondina re

Articolo di Ottobre 2009

Studio condotto da:

Çagla Eroglu, Nicola J. Allen, Michael W. Susman, Nancy A. O'Rourke, Chan Young Park, Engin Özkan, Chandrani Chakraborty, Sara B. Mulinyawe, Douglas S. Annis, Andrew D. Huberman, Eric M. Green, Jack Lawler, Ricardo Dolmetsch, K. Christopher Garcia, Stephen.

Titolo originale: "Gabapentin Receptor α2δ-1 Is a Neuronal Thrombospondin Receptor Responsible for Excitatory CNS Synaptogenesis" Stanford University School of Medicine

Articolo originale su Pub Med:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2791798/

Estratto:

Le sinapsi sono adesioni cellulari asimmetriche che sono fondamentali per lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso, ma i meccanismi che inducono la loro formazione non sono ben compresi. Abbiamo precedentemente identificato la trombospondina come una proteina secreta da astrociti che promuove la sinaptogenesi del SNC. Qui identifichiamo il recettore della trombospondina neuronale coinvolto nella formazione di sinapsi del SNC come α2δ-1, il recettore per il gabapentin antiepilettico e analgesico. Mostriamo che il dominio VWF-A di α2δ-1 interagisce con le ripetizioni del fattore di crescita epidermico comuni a tutte le trombospondine. La sovraespressione di α2δ-1 aumenta la sinaptogenesi in vitro e in vivo ed è richiesta postsinapticamente per la formazione di sinapsi indotta da trombospondina e astrociti in vitro. Il gabapentin antagonizza il legame della trombospondina con α2δ-1 e inibisce potentemente la formazione della sinapsi eccitatoria in vitro e in vivo. Questi risultati identificano α2δ-1 come un recettore coinvolto nella formazione di sinapsi eccitatoria e suggeriscono che il gabapentin possa funzionare bloccando la formazione di nuove sinapsi.

INTRODUZIONE

Le sinapsi del sistema nervoso centrale (SNC) sono complesse aderenze cellula-cellula tra i neuroni. La loro costituzione richiede un'interazione tra assoni e dendriti, accompagnata dall'organizzazione apposita delle specializzazioni pre e postsinaptiche. Diverse molecole di superficie delle cellule neuronali e segnali secretati hanno mostrato di condurre all'organizzazione e alla maturazione sinaptica (Fox e Umemori, 2006), ma le molecole che regolano la formazione delle aderenze sinaptiche iniziali rimangono scarsamente comprese. È stato dimostrato che gli astrociti giocano un ruolo attivo nella formazione delle sinapsi (Eroglu et al., 2008). Abbiamo precedentemente identificato trombospondine (TSP) come un segnale sinaptogenico necessario e sufficiente secreto dagli astrociti che aumenta il numero di sinapsi (Christopherson et al., 2005). Il TSP è presente nei mezzi a base di astrociti (ACM) ed è responsabile della capacità degli astrociti di aumentare il numero di sinapsi in vitro (Christopherson et al., 2005). I TSP sono importanti anche per la formazione della sinapsi in vivo. I topi con TSP1 / 2 hanno una significativa riduzione del numero di sinapsi eccitatorie. TSP1 e 2 sono espressi durante la prima età postnatale quando si formano la maggior parte delle sinapsi e queste proteine ​​sono assenti dal cervello adulto quando la quantità di sinaptogenesi eccitatoria è significativamente ridotta (Christopherson et al., 2005). I livelli di CNS TSP1 / 2 sono sovraregolati, e la mancanza di TSP1 / 2 dispari sinaptico e recupero funzionale da ictus (Liauw et al., 2008). TSP è in grado di promuovere l'adesione sinaptica e avviare gli eventi che portano alla creazione di specializzazioni pre e postsinaptiche. È interessante notare che queste sinapsi indotte da TSP sono identiche ultrastrutturalmente a sinapsi pienamente sviluppate e sono presinapticamente attive nella loro funzione post-silenziosa per via della mancanza di recettori AMPA di superficie. Gli astrociti secernono un secondo segnale non correlato che è in grado di convertire queste sinapsi silenziose in quelle completamente attive (Christopherson et al., 2005) e N. A. e B. A. B. dati non pubblicati).

I TSP sono grandi proteine ​​a matrice oligomerica, multidominio, extracellulare che hanno dimostrato di svolgere ruoli importanti nell'attaccamento cellulare, nella migrazione cellulare, nella dinamica citoscheletrica e nell'angiogenesi (Bornstein et al., 2004). TSP media queste funzioni attraverso la sua interazione con vari recettori di superficie cellulare attraverso domini specifici (Adams e Lawler, 2004). Abbiamo ipotizzato che i TSP inducano la formazione di sinapsi interagendo con un recettore della superficie cellulare neuronale. Qui mostriamo che i TSP mediano la sinaptogenesi attraverso i loro domini simili al fattore di crescita epidermico (EGF), comuni a tutte le isoforme di TSP. Usando questo dominio informazioni, abbiamo identificato il recettore gabapentin α2δ-1 come il recettore TSP coinvolto nella formazione di sinapsi. α2δ-1 (cacna2d1) era originariamente isolato come una subunità non essenziale del complesso del canale del calcio di tipo L dal muscolo scheletrico (Arikkath and Campbell, 2003) e si lega anche ad altre proteine ​​(Kaltenbach et al., 2007). L'α2δ-1 è ubiquamente espresso in molti tessuti ed è altamente espresso da molti neuroni del SNC (Cole et al., 2005) incluse le cellule gangliari retiniche (RGC). α2δ-1 è tradotto da un singolo prodotto genico, che viene scisso post-traducibile in parti α2 e δ che rimangono associate tramite ponti disolfuro. La parte α2 della proteina (~ 950 amminoacidi) è interamente extracellulare mentre la parte δ ha una piccola parte extracellulare che è attaccata a α2, e un dominio transmembrana con una coda citoplasmatica molto breve che lega la proteina alla membrana (Davies et al., 2007). Molte ricerche su α2δ-1 si sono concentrate sul suo ruolo nella regolazione della funzione e della tratta di canali del calcio. Tuttavia, la presenza di una vasta regione extracellulare contenente una ben nota plica di interazione proteina-proteina, il dominio Von Willebrand A (VWF-A), suggerisce che questa proteina possa servire da recettore per i ligandi extracellulari. Un recente studio sulle cellule muscolari scheletriche, che esprimono alti livelli di α2δ-1, ha descritto un tale ruolo per α2δ-1 nell'accesso al miooblasto e nella segnalazione extracellulare che è indipendente dalla funzione del canale del calcio (Garcia et al., 2007).

α2δ-1 è il recettore ad alta affinità per due farmaci anti-epilettici, anti-dolore neuropatico comunemente prescritti, gabapentin (GBP, Neurontin) e pregabalin (Lyrica) (Gee et al., 1996). GBP e pregabalin sono stati inizialmente progettati come analoghi idrofobi dell'acido gamma butirrico-butirrico (GABA) che potrebbero attraversare la barriera emato-encefalica. Ulteriori studi hanno dimostrato che anche se possiedono proprietà anti-convulsive, non si legano ai recettori o ai trasportatori del GABA. Uno studio recente che utilizza un topo knock-in che esprime un α2δ-1 mutante che non può legare GBP o pregabalin ha dimostrato che α2δ-1 è il target in vivo per questi farmaci e che questi farmaci mediano la loro azione terapeutica attraverso il legame a α2δ- 1 (Field et al., 2006). GBP o pregabalin non influenzano la cinetica a canale singolo dei canali del calcio e hanno solo effetti modesti sulla neurotrasmissione (Dooley et al., 2007). Quindi i meccanismi cellulari alla base della modalità di azione di questi farmaci non sono chiari. In questo studio, mostriamo che domini di TSP di tipo EGF si legano direttamente a α2δ-1 e mediano la sua attività che induce la sinapsi attraverso questo recettore. Questi risultati identificano α2δ-1 come un recettore TSP neuronale che è richiesto per la formazione di sinapsi del SNC. Questa funzione di α2δ-1 è indipendente dalla funzione del canale del calcio. Mostriamo anche che GBP è un potente inibitore della formazione di sinapsi eccitatoria indotta da TSP / astrociti in vitro e in vivo. Questa funzione della GBP potrebbe essere una parte centrale del suo meccanismo d'azione.

RISULTATI

Tutte le isoforme di TSP inducono la formazione di sinapsi Ci sono cinque isoforme di TSP nei mammiferi, che si dividono in due gruppi in base alla loro struttura di dominio e agli stati di oligomerizzazione (Figura 1A). Sottogruppo Trimeric I TSP, TSP1 e 2, sono sinaptogeni (Christopherson et al., 2005). Per determinare se i TSP del sottogruppo B pentamerico siano anche sinaptogeni, gli RGC sono stati coltivati in presenza di astrociti, o con TSP 1, 3, 4 o 5. Tutti i sottogruppi B TSP hanno aumentato significativamente il numero di sinapsi a livelli simili a quelli di TSP1 o astrociti (Figure 1B- 1D). Questi risultati suggeriscono che il dominio sinaptogenico di TSP si trova nella porzione C-terminale conservata di TSP, che è comune a tutte le isoforme che attraversano le ripetizioni simili all'EGF, le ripetizioni di legame al calcio e il dominio globulare simile alla L-tipo C-terminale L .

L'attività sinaptogenica delle mappe TSP alle ripetizioni simili all'EGF I TSP interagiscono con un numero di noti recettori di superficie cellulare attraverso specifici domini (Adams e Lawler, 2004). Per identificare il dominio sinaptogenico di TSP, abbiamo trattato gli RGC con un pannello di costrutti di troncamento ricombinante di TSP1 e 2. I frammenti TSP che contenevano le ripetizioni simili a EGF hanno imitato la capacità di TSP a lunghezza intera di indurre sinapsi (Figure 2B-2C) . Un frammento contenente la terza ripetizione simile a EGF insieme alla regione C-terminale di TSP2 ha anche aumentato significativamente il numero di sinapsi, tuttavia, il terzo dominio EGF simile non ha indotto un aumento significativo nel numero di sinapsi (Figura 2C).

Abbiamo confermato l'importanza delle ripetizioni simili all'EGF nella formazione di sinapsi bloccando funzionalmente l'effetto sinaptogenico del TSP su RGC in coltura, utilizzando anticorpi monoclonali diretti contro epitopi diversi di TSP (Figura 2D). Anticorpi monoclonali contro il secondo (HB8432 e C6.7 (Annis et al., 2007)) o terze ripetizioni simili a EGF (A4.1 (Annis et al., 2006)) hanno bloccato l'effetto sinaptogenico di TSP mentre un anticorpo contro il Dominio N-terminale (mAb200-1) no (Figura 2E). Per aiutarci nei nostri sforzi per identificare il recettore TSP neuronale coinvolto nella formazione di sinapsi, abbiamo espresso e purificato un frammento TSP2 marcato con myc e 6-Histidine contenente tutte e tre le ripetizioni simili a EGF (Figure S1A-S1B). Questo frammento TSP2 (designato SD2 per dominio sinaptogenico 2) era fortemente sinaptogenico (Figure S1C-S1D). Collettivamente, questi dati suggeriscono che la formazione di sinapsi indotta da TSP è mediata da un'interazione che coinvolge ripetizioni simili a EGF di TSP.

α2δ-1 interagisce con il dominio sinaptogenico di TSP È stato dimostrato che i domini simili a EGF di TSP4 si legano al dominio VWF-A dell'integrina αM (Pluskota et al., 2005). Quindi, abbiamo studiato se integrina αM o altro dominio VWF-A contenente integrine in RGCs fossero coinvolti nella formazione di sinapsi indotta da TSP. Nessuna delle integrine che contenevano il dominio VWF-A e sono state espresse da RGCs erano cruciali per l'attività sinaptogenica di TSP (non mostrata). Un'altra classe di proteine ​​di superficie cellulare che contiene domini VWF-A è la famiglia delta alfa2 (α2δ). Tra le proteine ​​α2δ clonate fino ad oggi (Klugbauer et al., 2003), le RGC esprimono alti livelli di α2δ-1 (Figura S2A). Abbiamo studiato se α2δ-1 è localizzato nelle sinapsi utilizzando la tomografia a matrice (Micheva e Smith, 2007). Le sezioni ultrasottili della corteccia di ratto o LGN del topo sono state immunomarcate con anticorpi contro α2δ-1 e i marcatori pre e postsinaptici synapsin e MAGUK. α2δ-1 ha dato uno schema di colorazione puntato. Alcuni puncta α2δ-1 localizzati in sinapsi identificati come puncta pre e post-sinaptica giustapposti mentre alcuni co-localizzati esclusivamente con puncta pre o post-sinaptica (Figura 3A e Figura S2B).

Per determinare se α2δ-1 interagisce con i TSP, abbiamo TSPs 1, 2 e 4 immunoprecipitati dal lisato della corteccia cerebrale di ratto P5. α2δ-1 è stato rilevato in frazioni di immunoprecipitazione eseguite utilizzando ciascuno dei tre anticorpi TSP (Figura 3B) che suggerisce che α2δ-1 e TSP interagiscono in vivo. Per verificare se esiste un'interazione vincolante diretta e specifica tra il dominio sinaptogenico di TSP e α2δ-1, abbiamo co-espresso un tag FLAG-tag α2δ-1 da solo (Figura 3C, corsia 2), con SD2 (corsia 4) o con una proteina di controllo secreta non correlata che conteneva una ripetizione simile all'EGF (Control-myc-his, corsia 5). Per immunoprecipitare α2δ-1-FLAG sono state utilizzate perline coniugate con un anticorpo anti-tag FLAG. SD2 co-immunoprecipitated con α2δ-1-FLAG ma Control-myc-sua proteina non ha (Figura 3C, corsie 8 e 9, rispettivamente), suggerendo che α2δ-1 in particolare interagisce con i domini sinaptogenici simili a EGF di TSP. Abbiamo ipotizzato che i domini simili a EGF di TSP interagiscano con il dominio VWF-A di α2δ-1, che risiede nella regione α2 della proteina. Per verificare ciò, tre costrutti α2δ-1, il dominio α2δ-1, α2 o VWF-A a lunghezza intera, ciascuno con un tag C-Terminal Protein C (PC) per la purificazione (Figura 3D) sono stati co-espressi con SD2. Quando eseguivamo le purificazioni di affinità dei tag PC, potevamo rilevare l'SD2 in tutte e tre le frazioni purificate (Figura 3E, corsie 7,8 e 9). SD2 non ha co-purificato con una proteina di membrana non correlata che conteneva anche lo stesso tag PC (Figura 3E, corsia 6). Questi dati mostrano che TSP e α2δ-1 interagiscono attraverso i domini sinaptogenici simili all'EGF di TSP e il dominio VWF-A di α2δ-1.

α2δ-1 è il recettore neuronale TSP coinvolto nella formazione di sinapsi Per determinare se α2δ-1 svolge un ruolo nella formazione della sinapsi indotta da TSP in vitro, abbiamo sovraespresso α2δ-1 in RGCs e testato se la formazione di sinapsi indotta da SD2 è stata influenzata. Gli RGC che hanno sovraespresso α2δ-1 (identificato con co-espressione GFP) hanno ricevuto il doppio delle sinapsi in risposta all'SD2, così come gli RGC trasfettati con vettore vuoto (Figura 4A), indicando che la sovraespressione di α2δ-1 migliora la formazione di sinapsi indotta da TSP. La sovraespressione di α2δ-1 non era sufficiente per indurre la formazione di sinapsi in assenza di SD2, suggerendo che SD2 è richiesto per il potenziamento della formazione di sinapsi da α2δ-1.

Per determinare quale regione della proteina α2δ-1 fosse responsabile del suo potenziamento della formazione di sinapsi indotta da SD2 abbiamo utilizzato due costrutti α2δ-1 (schematizzati nella Figura 4A). Sovraespressione di un costrutto "α2δ-1Adh" che contiene l'intera regione extracellulare di α2δ-1 seguita dal dominio transmembrana da una proteina di membrana di tipo 1 non correlata adhalin (Gurnett et al., 1996) imitata dall'effetto della piena lunghezza α2δ-1 nel potenziare la formazione di sinapsi indotta da SD2 (Figura 4A) suggerendo che la regione critica di α2δ-1 si associa alla parte extracellulare della proteina. Successivamente abbiamo sovraespresso un costrutto "δ-1 only" (privo della regione α2), che ha inibito la formazione di sinapsi indotta da SD2 (Figura 4A), indicando che la regione α2 contenente VWF-A è necessaria per potenziare la sinaptogenesi e che le regioni all'interno di δ-1 può essere coinvolto nella regolazione delle interazioni a valle che sono critiche per la formazione di sinapsi indotta da TSP. Poiché il dominio VWF-A di α2δ-1 lega TSP, abbiamo studiato se anticorpi contro il dominio VWF-A di α2δ-1 interferirebbero con la formazione di sinapsi indotta da TSP. Due anticorpi monoclonali diretti contro il dominio VWF-A di α2δ-1, 5A5 e 3B4, hanno riconosciuto α2δ-1 in Western Blot e hanno macchiato la superficie delle cellule HEK293 con sovraesprimono α2δ-1 (Figura S3A-S3B). Quando gli RGC venivano coltivati ​​con questi anticorpi in presenza o in assenza di TSP e analizzati il ​​numero di sinapsi, sia la 5A5 che la 3B4 inducevano la formazione di sinapsi simile a TSP. Un anticorpo di controllo (OX7) contro un altro recettore di superficie RGC (Thy1) non ha influenzato la formazione di sinapsi. L'effetto sinaptogenico di 5A5 o 3B4 non era additivo con quello di TSP (Figura 4B). Questi dati mostrano che il legame degli anticorpi al dominio VWF-A può simulare la funzione sinaptogenica del TSP e suggerire che l'interazione di TSP con il dominio VWF-A di α2δ-1 è importante per l'inizio della formazione della sinapsi. Tali anticorpi analoghi al ligando sono stati descritti anche per il dominio VWF-A contenente integrine (Wilkins et al., 1996).

Per determinare se α2δ-1 è richiesto per la formazione di sinapsi indotta da TSP, abbiamo usato un approccio di knockdown interferente con RNA (siRNA). Un pool di siRNA specifico per il ratto α2δ-1 ha ridotto significativamente l'espressione del ratto α2δ-1 nelle cellule HEK293 transfected (Figura 4C). Atterramento di α2δ-1 in RGCs con questo pool di siRNA inibito la formazione di sinapsi indotta da astrociti o TSP in vitro (Figure 4D-4E), mentre il pool di siRNA di controllo non targeting (siControl) non ha influenzato la formazione di sinapsi (Figure 4C-4D) . Per dimostrare che la riduzione della formazione di sinapsi da parte degli α2δ-1 siRNA era dovuta al knockdown specifico di α2δ-1, abbiamo testato se l'inibizione di siRNA potesse essere salvata co-esprimendo un costrutto α2δ-1 siRNA resistente. Uno dei siRNA contro il ratto α2δ-1, siα2δ-1 Duplex 9, ha bloccato l'iperespressione del ratto α2δ-1, ma non l'α2δ-1 umano nelle cellule HEK293 (Figura S4). Quando abbiamo co-trasfettato RGCs con siα2δ-1 (9) e il costrutto umano α2δ-1 abbiamo salvato SD2 o formazione di sinapsi indotta da astrociti (Figura 4F), mostrando che siRNA knockdown di α2δ-1 blocca sinaptogenesi tramite inibizione specifica del ratto α2δ -1 mRNA. Presi insieme questi risultati dimostrano che α2δ-1 è necessario per la formazione di sinapsi indotta da TSP e da astrociti in vitro. Poiché analizziamo l'effetto della sovraespressione e del knockdown α2δ-1 nelle cellule postsinaptiche che ricevono sinapsi, questi dati mostrano una sufficienza postsinaptica e la necessità di α2δ-1 nella formazione di sinapsi indotta da astrociti / TSP.

La formazione di sinapsi α2δ-1 mediata non dipende dal livello o dalla funzione della superficie del canale del calcio α2δ-1 è noto per migliorare la funzione e il traffico del canale del calcio (Arikkath and Campbell, 2003). Abbiamo quindi studiato se l'attività di α2δ-1 nella formazione di sinapsi è legata al suo ruolo nell'aumentare le correnti di calcio o i livelli dei canali del calcio. L'analisi dell'espressione genica degli RGC mostra che queste cellule esprimono prevalentemente i canali voltaggio-sinaptici tipo L e pre-sinaptici di tipo voltaggio G e P / Q (VGCC). Per verificare direttamente se la funzione VGCC fosse necessaria per la formazione della sinapsi indotta da astrociti, abbiamo aggiunto bloccanti del canale del calcio di tipo L agli RGC per bloccare la funzione del canale di tipo L. Questi farmaci non hanno avuto alcun effetto sulla formazione di sinapsi indotta da SD2 (Figura S5A). Analogamente, i bloccanti dei canali di tipo pre-sinaptico N e P / Q non hanno bloccato la formazione di sinapsi indotta da TSP (non mostrata). Abbiamo poi esaminato se l'aumento dell'espressione del canale del calcio di tipo L postsinaptico in RGCs migliorerebbe la formazione di sinapsi. Sovraespressione di subunità α1C e β di tipo L in RGCs non ha avuto effetti sulla formazione di sinapsi indotta da astrociti (Figura S5B). Alla fine abbiamo testato se il trattamento con TSP avrebbe portato ad un aumento dei livelli di calcio citoplasmatico negli RGC. Né il trattamento TSP acuto né a lungo termine ha portato a un notevole aumento delle oscillazioni spontanee del calcio negli RGC (Figura S6). Presi insieme questi risultati mostrano che il ruolo di α2δ-1 nella formazione di sinapsi non può essere direttamente collegato ai livelli o alla funzione di espressione del canale del calcio.

La sovraespressione di α2δ-1 nei neuroni migliora la formazione di sinapsi in vivo Per determinare se α2δ-1 svolge un ruolo nella formazione di sinapsi in vivo abbiamo esaminato il numero di sinapsi e l'attività sinaptica in topi transgenici che sovraesprimono selettivamente α2δ-1 nei neuroni del SNC, sotto il controllo del promotore di Thy1 (Li et al., 2006). Sezioni di cervello sagittale da topi di littermate transgenici (TG) e wildtype (WT) di 21 giorni (P21) sono stati co-immunocolorati per PSD95 e sia il trasportatore di glutammato vescicolare presinaptico 1 o 2 (VGlut1 e VGlut2). Abbiamo quantificato il numero di puncta pre-postsinaptico e localizzato per determinare la densità sinaptica nelle cortecce di questi topi. I topi TG avevano un numero significativamente più elevato di sinapsi eccitatorie positive VGlut2 nella corteccia rispetto ai controlli WT littermate (1,8 volte, Figure 5A-5B), tuttavia non vi era alcuna differenza nel numero di sinapsi positive VGlut1 tra topi WT e TG ( S7A-S7B). L'osservazione che la sovraespressione di α2δ-1 aumenta le sinapsi positive di VGlut2 fornisce la prova che la formazione di sinapsi eccitatoria è migliorata nei TG.

Nella corteccia adulta i neuroni talamici proiettando su neuroni IV di livello formano sinapsi positive VGlut2, mentre le sinapsi fatte tra neuroni corticali contengono VGlut1 (Fremeau et al., 2004). Abbiamo confermato che l'aumento del numero di sinapsi positivi VGlut2 non era dovuto ad un aumento del numero di neuroni nella corteccia o nel talamo, poiché il numero di cellule e neuroni nei cervelli WT e TG era identico in queste regioni del cervello (Figure S8A-S8B ). Le sinapsi eccitatorie nella corteccia sono inizialmente formate come VGlut2 positive, e c'è un passaggio di isoforme a VGlut1 che avviene intorno alla seconda settimana di sviluppo postnatale (Miyazaki et al., 2003). Durante questo periodo alcune sinapsi possono transitoriamente essere sia VGlut1 che 2 positive (Nakamura et al., 2005). Abbiamo determinato che l'aumento delle sinapsi positive VGlut2 non era dovuto a una prolungata co-localizzazione di VGlut1 e 2 alla stessa sinapsi, dal momento che queste proteine ​​raramente co-localizzate a P21, e non c'erano differenze nella frequenza di co-localizzazione di queste proteine ​​tra genotipi (figure S9A-S9B). Presi insieme questi risultati mostrano che l'aumento delle sinapsi VGlut2 positive associate alla sovraespressione di α2δ-1 non è dovuto né ad un aumento del numero di neuroni corticali o talamici né a causa di un ritardo nel passaggio dell'isoformio da VGlut2 a 1 nella corteccia. Oltre ad analizzare il numero di sinapsi mediante immunoistochimica, abbiamo eseguito registrazioni patch-clamp a cellule intere nei neuroni piramidali corticali di IV livello e saggiato il numero di sinapsi attive analizzando la frequenza e l'ampiezza delle correnti postsinaptiche eccitatorie miniaturizzate (mEPSC). Le cellule registrate sono state riempite con colorante e la loro identità è stata verificata (Figure S10A-S10B). Abbiamo preso di mira i neuroni piramidali di IV livello sia perché queste cellule ricevono sinapsi VGlut2 positive sia perché la tomografia a matrice ha rivelato un aumento dell'immunocolorazione di α2δ-1 negli animali TG in questo strato (Figura S10C). C'è stato un aumento significativo della frequenza dei mEPSC nei topi α2δ-1 TG rispetto al WT (1,63 volte), senza alcun effetto sull'ampiezza dei mEPSC (Figure 5C-5E). L'aumento della frequenza dei mEPSC nei topi TG è molto coerente con l'aumento del numero di sinapsi eccitatorio rilevato mediante l'analisi immunoistochimica sopra descritta. Presi insieme, questi dati mostrano che α2δ-1 svolge un ruolo nel promuovere la formazione di sinapsi eccitatoria nel cervello.

Gabapentin, il ligando ad alta affinità per α2δ-1, ha fortemente inibito la formazione di sinapsi indotta da TSP Per determinare se la GBP, il ligando ad alta affinità per α2δ-1, TSP colpisce formazione di sinapsi oro astrociti indotta, abbiamo coltivato RGCs con TSP, SD2 o ACM in presenza o assenza di GBP (32μM). GBP ha fortemente inibito la formazione di sinapsi indotta da TSP, SD2 o astrociti (Figura 6A-6C, Figura S1C). Per determinare se abbiamo già stabilito le sinapsi, abbiamo aggiunto ulteriori GBP per un giorno aggiuntivo. GBP non ha avuto effetto sul numero di sinapsi quando aggiunto dopo la formazione delle sinapsi (Figura 6C). Così GBP blocca la nuova formazione di sinapsi indotta da TSP e astrociti, ma non dissolve le sinapsi stabilite. È interessante notare, GABA, un neurotrasmettitore inibitorio che si legano al α2δ 1 con affinità molto più bassa (IC50 = 650μM ;. (Suman-Chauhan et al, 1993)), aussi bloccato SD2-indotta Quando utilizzato sinapsi formazione a concentrazioni elevate (Figura S11) .

Per determinare se GBP blocca la formazione di sinapsi indotta da TSP inibendo l'interazione α2δ-1-TSP, abbiamo co-coltura due popolazioni di cellule HEK293, una che esprime α2δ-1FLAG e l'altra che esprime SD2, in presenza o assenza di GBP. Immunoprecipitazione con anticorpi anti-FLAG ha rivelato che l'interazione SD2-α2δ-1 era diminuita in presenza di GBP (Figura 6D) suggerendo che GBP blocca la formazione di sinapsi indotta da TSP interferendo con l'interazione tra α2δ-1 e TSP. Per verificare se GBP in modo simile blocca la formazione di sinapsi in vivo, abbiamo iniettato topi neonatali con GBP o soluzione salina per la prima settimana postnatale, che coincide con l'inizio della formazione di sinapsi nel cervello. A questa età le sinapsi glutammatergiche nella corteccia sono prevalentemente positive a VGlut2 (Miyazaki et al., 2003). Pertanto, abbiamo co-immunostainato sezioni del cervello sagital da salina P7 o topi iniettati GBP con anticorpi contro VGlut2 e PSD95 e quantificato il numero di puncta pre-postsinaptico e co-localizzato nella corteccia di questi topi. C'erano significativamente meno sinapsi eccitatorie nella corteccia cerebrale dei topi iniettati in sterline rispetto ai topi di controllo (Figura 6E). Questa differenza era principalmente dovuta a una grave diminuzione del numero di sinapsi in metà degli animali iniettati GBP. Nei topi che hanno risposto con forza alla sterlina, le densità sinaptiche di VGlut2 / PSD95 sono diminuite profondamente, a meno del 10% dei valori iniettati di soluzione salina, sebbene il numero di neuroni non sia cambiato. L'iniezione di GBP ha influenzato sia la VGlut2 che la puncta PSD95 riducendo il numero, la dimensione e la co-localizzazione (Figura 6E) in modo simile al suo effetto sul puncta sinaptico in vitro. Questi risultati mostrano che GBP è un potente inibitore della nuova formazione di sinapsi sia in vitro che in vivo.

L'inibizione della formazione di sinapsi indotta da TSP interferisce con la plasticità della corteccia di barrel indotta dalla lesione Per determinare se la formazione di sinapsi indotta dagli astrociti è coinvolta nel rimodellamento dei circuiti neurali durante lo sviluppo, abbiamo utilizzato un paradigma di plasticità evolutiva ben definito, il saggio 'plasticità della corteccia di barrel'. I nervi che innervano i principali baffi sul muso del topo proiettano al cervello come una mappa "somatotopica" topograficamente ordinata (Erzurumlu et al., 2006). Nella corteccia somatosensoriale primaria questa mappa è organizzata come "barrel" (Figura 7A) che mostrano cambiamenti strutturali in risposta alle manipolazioni periferiche dei baffi.

Per verificare se la formazione di sinapsi indotta da TSP è coinvolta in meccanismi di plasticità esperienza-dipendente, abbiamo iniettato due gruppi di topi neonatali sia con GBP o soluzione salina ogni giorno a partire da P0 fino a P7. In P1, cinque baffi della fila C su un lato di ciascun topo sono stati lesionati. I topi sono stati sacrificati a P7 e l'organizzazione della corteccia di barrel in entrambi i "controlli" non menzionati e l'emisfero lesionato è stato analizzato. Sia i topi iniettati in soluzione salina che quelli in sterline avevano una tipica organizzazione a botte formata sul lato del controllo (Figura 7B, due pannelli in alto a sinistra). Sul lato lesionato, mentre tutti i topi iniettati con soluzione salina mostravano un normale pattern di plasticità della corteccia di barrel, il 50% dei topi iniettati con GBP mostrava una risposta di plasticità atipica (Figura 7B, pannelli di destra), dove le righe A e B e la riga C ha perso forma e si è fuso, anche se i bozzoli dei baffi per queste file erano indisturbati in tutti i topi (Figura 7B-7C e Figura S12). Per testare più direttamente il ruolo dei TSP, abbiamo esaminato la plasticità della corteccia di barrel in topi TSP1 / 2 double null (KO). Un terzo dei topi TSP1 / 2KO che abbiamo analizzato ha mostrato un fenotipo di plasticità della corteccia di barrel aberrante molto simile (Figura 7B, in basso a destra), un pattern che non abbiamo mai osservato in nessuno dei topi WT. Questi risultati suggeriscono che i TSP secretati dagli astrociti sono necessari per il ricablaggio di barrel dopo il trauma e che l'effetto principale del GBP nella plasticità della corteccia di barrel è mediato dalla sua inibizione della formazione di sinapsi indotta da TSP.

DISCUSSIONE

α2δ-1 è il recettore neuronale della trombospondina responsabile della sinaptogenesi Le interazioni molecolari che regolano l'inizio della formazione di sinapsi non sono ben caratterizzate. La nostra scoperta che α2δ-1 è il recettore TSP richiesto per la sinaptogenesi fornisce una visione molecolare del meccanismo di formazione della sinapsi e solleva la questione di come l'interazione TSP-α2δ-1 porti all'iniziazione della sinaptogenesi. Le nostre scoperte ci portano al seguente modello di lavoro: α2δ-1 è la porzione legante extracellulare di un "complesso di segnalazione sinaptogenico" postsinaptico (Figura Supplementare S13) che regola la formazione di un'adesione sinaptica iniziale tra un dendrite e un assone. Il legame TSP al dominio VWF-A di α2δ-1 provoca un riarrangiamento strutturale in questa molecola, che innesca i successivi spostamenti conformazionali nei suoi partner di legame e trasforma questo complesso in uno stato "attivo". L'attivazione di α2δ-1 da parte di TSP porta quindi a eventi di segnalazione inter- e intracellulari che attivano il reclutamento di molecole di adesione sinaptica e di ponteggio a siti sinaptici nascenti. I domini di VWF-A sono noti domini di interazione proteina-proteina che agiscono come interruttori conformazionali e alterano la struttura di una proteina quando si legano al suo ligando (Bork and Rohde, 1991; Whittaker e Hynes, 2002). Il fatto che gli anticorpi diretti contro il dominio VWF-A di α2δ-1 possano imitare la funzione sinaptogenica di TSP suggerisce anche un'attivazione indotta da legame di α2δ-1 nella formazione di sinapsi. È improbabile che α2δ-1 possa indurre la segnalazione intracellulare da sola poiché ha una coda citoplasmatica molto breve e il dominio extracellulare di α2δ-1 è in grado di simulare la funzione di α2δ-1 a piena lunghezza nella formazione di sinapsi. α2δ-1 può essere collegato ai meccanismi di segnalazione intracellulare tramite altre proteine ​​di membrana. Una subunità α1 del canale del calcio può essere una parte di questo complesso. α1, dopo essere stato reclutato da α2δ-1 a siti di contatto dendrite-assone, potrebbe subire cambiamenti conformazionali indotti dall'interazione TSP-α2δ-1 e potenzialmente servire da piattaforma per la nucleazione di proteine ​​sinaptiche nel nuovo sito sinaptico (Figura S13 Supplementare) .

È stato precedentemente dimostrato che α2δ-1 aumenta le correnti di calcio e il traffico di superficie delle subunità α1 del canale del calcio (Arikkath and Campbell, 2003). Il ruolo di α2δ-1 nella formazione di sinapsi è collegato a questa funzione? Abbiamo diverse osservazioni che suggeriscono diversamente. Innanzitutto, la sovraespressione di α2δ-1 in assenza di TSP migliora l'espressione della superficie del canale del calcio (Gurnett et al., 1996), ma non porta ad un aumento del numero di sinapsi. In secondo luogo, la proteina α2δ-1Adh può imitare l'effetto di α2δ-1 a lunghezza intera nell'aumentare la formazione di sinapsi, ma non induce l'aumento delle correnti di calcio come proteina a lunghezza intera (Gurnett et al., 1996). In terzo luogo, né la sovraespressione né il blocco farmacologico dei canali del calcio hanno interferito con la formazione di sinapsi indotta da TSP. Allo stesso modo, il trattamento TSP acuto o a lungo termine non ha aumentato i livelli di calcio citoplasmatico negli RGC, quindi è improbabile che il TSP inneschi l'attivazione di un meccanismo omeostatico in grado di attivare la formazione di sinapsi. Presi insieme i nostri risultati mostrano che i cambiamenti globali nei numeri o nelle correnti di canali del calcio non sono coinvolti nella formazione di sinapsi indotta da TSP. Tuttavia, poiché il costrutto α2δ-1Adh, che migliora la formazione di sinapsi, può interagire con la subunità α1, e poiché il δ-1, che inibisce la formazione di sinapsi, può interferire con l'interazione α2δ-1 e α1, un'interazione fisica tra α2δ-1 e le subunità α1 del canale del calcio potrebbero essere importanti per la formazione della sinapsi. Studi futuri che esplorano se abbattere espressione di subunità α1 influenzano la formazione di sinapsi indotta da TSP sono necessari per verificare questa possibilità. α2δ-1 potrebbe anche interagire con altre proteine ​​coinvolte nell'organizzazione dei contatti sinaptici. Tali duali funzioni sono state descritte per le subunità γ dei VGCC, noti anche come stargazini. Inizialmente erano isolati come componenti del complesso del canale del calcio, ma ora sono noti per giocare un ruolo primario nella regolazione del recettore AMPA (Chen et al., 2000). L'identificazione delle molecole interagenti α2δ-1 promette di fornire una nuova visione molecolare nel processo di formazione della sinapsi. Inoltre potrebbero esserci altre molecole del CNS che condividono le capacità di TSP e GBP di legarsi a α2δ-1 e innescare o inibire la formazione di sinapsi.

I nostri risultati hanno una serie di importanti implicazioni per studi futuri. Innanzitutto, TSP e α2δ-1 sono anche altamente concentrati nella giunzione neuromuscolare, quindi è probabile che queste molecole siano coinvolte nella formazione di questa sinapsi (Arber e Caroni, 1995; Arikkath and Campbell, 2003). In secondo luogo, altri membri della famiglia α2δ potrebbero anche regolare la formazione di sinapsi. Infatti, la rottura del gene α2δ-4 nei topi porta a una grave perdita di sinapsi del nastro nelle cellule dei fotorecettori (Wycisk et al., 2006) e le mutazioni in α2δ-3 causano difetti nella trasmissione sinaptica e un difetto morfologico in presinaptico organizzazione presso la giunzione neuromuscolare di Drosophila ((Dickman et al., 2008); comunicazione personale di T. Schwarz). Queste osservazioni suggeriscono che la funzione delle subunità α2δ nel promuovere la sinaptogenesi può essere conservata evolutivamente e può essere esercitata presinapticamente e postsinapticamente.

Il gabapentin è un potente bloccante della formazione di sinapsi I nostri risultati suggeriscono che GBP blocca la formazione di sinapsi indotta da TSP interferendo con l'interazione TSP-α2δ-1. Il legame GBP a α2δ-1 riguarda una regione appena a monte del dominio VWF-A in α2 (Wang et al., 1999). Pertanto è improbabile che TSP e GBP competano per lo stesso sito di rilegatura. È noto per le integrine che i cambiamenti conformazionali nei domini VWF-A possono essere limitati dalle interazioni fatte dalle regioni che fiancheggiano questo dominio (Bork e Rohde, 1991; Whittaker e Hynes, 2002). Proponiamo che il legame GBP a α2δ-1 limiti la conformazione del dominio VWF-A e mantenga α2δ-1 nella sua "conformazione inattiva". Questo perturba l'interazione TSP-α2δ-1 e inibisce l'attivazione del complesso di segnalazione sinaptogenico (Figura Supplementare S13). GABA, leucina e isoleucina possono anche legarsi a α2δ-1, anche se con un'affinità inferiore a GBP (Dooley et al., 2007), quindi possono essere ligandi fisiologici per α2δ-1 e regolare la formazione di sinapsi eccitatoria. In accordo con questo abbiamo trovato che alte concentrazioni di GABA hanno inibito la formazione di sinapsi in coltura. Tali concentrazioni elevate di GABA sono presenti nel sistema nervoso centrale proprio accanto a un assone GABAergico. Il filopodia dendritico nel cervello in via di sviluppo cerca attivamente i partner sinaptici e stabilisce contatti esclusivamente glutammatergici. È interessante notare che il filopodia dendritico che contatta un assone GABAergico non stabilizza mai il contatto e la retrazione (Lohmann e Bonhoeffer, 2008; Wierenga et al., 2008). In studi futuri, sarà interessante esplorare se α2δ-1 funziona come un recettore GABA fisiologicamente rilevante che consente la selettività iniziale per la formazione di sinapsi eccitatorie mediante filopodia dendritica.

L'interazione α2δ-1-TSP regola la formazione di sinapsi durante lo sviluppo e dopo l'infortunio La capacità di GBP di diminuire fortemente la formazione di sinapsi nei cervelli di topo selvatico indica un ruolo fondamentale per l'interazione e gli astrociti di TSP-α2δ-1 nel guidare la sinaptogenesi in vivo. Inoltre, la corretta esecuzione della plasticità della corteccia di barrel dipende dalla formazione di sinapsi indotta da TSP. Dal momento che le cortecce di barrel non lesonate si formano normalmente sia in GBP iniettati e TSP1 / 2 topi KO, TSP potrebbe specificamente giocare un ruolo nel rimodellamento sinaptico-plasticità su lesioni in questo sistema. Questi risultati si aggiungono ai dati in crescita che gli astrociti non solo contribuiscono attivamente alla sinaptogenesi normale, ma mediano anche eventi di rimodellamento sinaptico dopo l'infortunio. È interessante notare che l'effetto di GBP in vivo è un effetto "tutto o nessuno" piuttosto che una diminuzione frazionaria del numero di sinapsi e solo il 50% dei topi ha risposto con forza alle iniezioni di GBP. È possibile che sia necessaria una concentrazione soglia critica di GBP nel liquido cerebrospinale per bloccare la formazione di sinapsi, che si ottiene solo a metà dei topi. Il genere potrebbe essere determinante per la reattività della GBP, influenzando la consegna della GBP ai tessuti neurali e può spiegare la penetranza del 50% che abbiamo osservato. In effetti, uno studio recente ha dimostrato che le iniezioni intraperitoneali di GBP non erano altrettanto efficaci nel bloccare le crisi nei topi femmina che nei maschi (Traa et al., 2008). Poiché GBP blocca fortemente la formazione di sinapsi indotta da TSP all'interno della sua concentrazione terapeutica, è possibile che l'inibizione della formazione di sinapsi eccitatoria sia una modalità importante della sua azione terapeutica nell'epilessia e nel dolore. astrocitosi reattiva è prominente sia nelle lesioni epilettiche e nel midollo spinale dopo la lesione dei nervi periferici che conduce al dolore neuropatico (Liu et al, 2000;.. Ridet et al, 1997). Gli astrociti reattivi esprimono alti livelli di TSP 1 e 2 (Lin et al., 2003). Allo stesso modo, a seguito di una lesione nel nervo spinale, entrambi i geni α2δ-1 e TSP4 sono sovraregolati nel midollo spinale (Valder et al., 2003; Wang et al., 2002). Aumentati livelli di α2δ-1 hanno dimostrato di portare a una maggiore trasmissione sinaptica eccitatoria e ad elevati stati di dolore neuropatico (Li et al., 2004; Li et al., 2006). Allo stesso modo, c'è un aumento dell'eccitazione nel cervello epilettico (Prince, 1999). Tutte queste osservazioni indicano la possibilità che una sinaptogenesi eccitatoria aberrante possa contribuire alla fisiopatologia del dolore neuropatico e dell'epilessia. Quindi GBP può agire limitando la formazione di queste sinapsi in eccesso, una possibilità che ora può essere direttamente testata nei modelli animali di queste malattie.

In conclusione, identificando α2δ-1 come un recettore per la formazione di sinapsi gliale indotta da TSP, abbiamo acquisito una comprensione molecolare non solo del ruolo degli astrociti nella formazione di sinapsi nella salute e nella malattia, ma anche del processo di formazione della sinapsi stessa.