Published: July 3, 2017
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180581
Autori: Rocco Liguori , Alex Incensi, Silvia de Pasqua, Renzo Mignani, Enrico Fileccia, Marisa Santostefano, Elena Biagini, Claudio Rapezzi, Silvia Palmieri, Ilaria Romani, Walter Borsini, Alessandro Burlina, Roberto Bombardi, Marco Caprini, Patrizia Avoni, Vincenzo Donadio.
La malattia di Fabry (FD in inglese) è caratterizzata dall'accumulo di globotriaosilceramide-3 (Gb3) in diversi tessuti e una neuropatia delle piccole fibre (SFN), tuttavia i meccanismi sottostanti sono scarsamente conosciuti. Questo studio mira a: 1) accertare la presenza di depositi di Gb3 in campioni di pelle, mediante un metodo di immunofluorescenza prelevato da pazienti FD con mutazioni classiche di GLA o varianti FD a insorgenza tardiva o polimorfismi GLA; 2) correlare i depositi cutanei di GB3 con l'innervazione cutanea. metodi abbiamo studiato 52 pazienti con FD geneticamente definiti (32 con mutazioni classiche di GLA e 20 con varianti a insorgenza tardiva o polimorfismi GLA), 15 pazienti con SFN associati a una causa specifica e 22 controlli sani. I soggetti sono stati sottoposti a biopsia cutanea per valutare i depositi di Gb3 e l'innervazione epipermale. risultati I depositi cutanei di Gb3 sono stati trovati in tutti i pazienti FD con mutazioni classiche di GLA, ma mai in pazienti con FD con varianti tardive o polimorfismi GLA o in pazienti con SFN e controlli sani. Depositi anormali sono stati trovati all'interno di diverse strutture della pelle ma mai all'interno degli assoni. I pazienti con FD con depositi GB3 hanno mostrato un innervamento cutaneo inferiore rispetto ai pazienti con FD con varianti o polimorfismi a insorgenza tardiva. conclusioni 1) I depositi cutanei di Gb3 sono specifici per i pazienti con FD con mutazioni classiche di GLA; 2) I depositi di Gb3 erano associati ad innervazione della pelle inferiore ma non sono stati trovati all'interno degli assoni, suggerendo un danno indiretto sull'innervazione delle piccole fibre periferiche.
introduzione Fabry Disease -malattia di Fabry-(FD) è un raro disordine x-linked [1] caratterizzato da una funzione anormale dell'enzima lisosomiale alfa-galattosidasi A (GLA) [2,3], coinvolto nella scissione dei residui di galattosio di globotriaosilceramide-3 (Gb3 ) [4]. Di conseguenza, Gb3 inizia ad accumularsi nei lisosomi di diversi tessuti che coinvolgono i vasi sanguigni, i reni, il sistema nervoso e il cuore, così come i fibroblasti dermici [5-8], tenendo conto delle caratteristiche cliniche di FD [9,10] includendo principalmente neuropatia delle piccole fibre (SFN) [11], ictus e disfunzioni renali e cardiache [12]. SFN è principalmente responsabile per parestesie di estremità, ipoidrosi, dolore addominale e diarrea [5,11,12] che spesso iniziano nell'infanzia con progressiva gravità per tutta la vita. La terapia enzimatica sostitutiva (ERT) disponibile è iniziata molto prima che la comparsa di insufficienza d'organo possa ridurre l'impatto patologico di questo disturbo [5]. La possibilità di rivelare depositi di pelle Gb3 è interessante perché la pelle è un tessuto facilmente accessibile. I depositi di Skin Gb3 sono stati dimostrati utilizzando tecniche complesse come la microscopia elettronica [13], ma possono anche essere rilevati con tecniche più semplici e rapide come la microscopia ottica [14,15]. Tuttavia, utilizzando quest'ultima tecnica, i depositi cutanei di Gb3 non sono stati trovati in tutti i pazienti analizzati [15,16], impedendo l'uso di questo approccio a scopi diagnostici. La ragione dell'assenza di depositi di Gb3 nei campioni di pelle di pochi pazienti FD è sconosciuta, sebbene sia stata suggerita una possibile correlazione con i livelli di liso-GL-3 nel plasma [15]. Tuttavia, i depositi cutanei di Gb3 nelle mutazioni di GLA classiche o ad insorgenza tardiva o nei controlli sani o nei pazienti con SFN di diversa origine per valutare la loro specificità in FD non sono stati precedentemente studiati. Inoltre, i meccanismi sottostanti l'SFN nella FD sono scarsamente conosciuti poiché i risultati contrastanti sono stati riportati negli animali [17] e nell'uomo [18-20]. Obiettivi specifici di questo studio sono: 1) accertare la presenza di depositi di Gb3 in campioni di pelle prelevati da pazienti FD con mutazioni classiche di GLA o varianti FD a insorgenza tardiva o polimorfismi GLA mediante un metodo di immunofluorescenza; e 2) per accertare la correlazione dei depositi cutanei Gb3 con l'innervazione cutanea.
Materiali e metodi Abbiamo studiato 52 pazienti con FD geneticamente definiti tra cui 14 maschi e 38 femmine (36 ± 15 vs 45 ± 14 anni, p = 0,05) che appartengono a 26 famiglie diverse (tabelle 1 e 2). I pazienti sono stati reclutati in diversi centri FD di terzo livello e valutati presso l'Istituto di Scienze Neurologiche IRCCS di Bologna. Hanno incluso 32 pazienti con mutazioni classiche di GLA; 17 pazienti con varianti FD a insorgenza tardiva e 3 pazienti con polimorfismi GLA, successivamente definiti come gruppo di mutazioni non classiche (Tabella 2). Per testare la specificità dei depositi cutanei di Gb3 in pazienti FD, sono stati anche analizzati Gb3 in 15 pazienti con SFN associati a cause specifiche (4 pazienti con diabete, 3 con malattia di Sjogren, 2 con epatite C, 3 con malattia di Parkinson e 3 con amiotrofica sclerosi laterale) e 22 controlli sani. I pazienti e i controlli SFN erano di sesso (5M: 10F e 10M: 12F rispettivamente) e di età corrispondente (49 ± 8 e 46 ± 18) rispetto ai pazienti FD
Le procedure utilizzate sono state approvate dal Comitato Etico Umano del Policlinico Sant'Orsola-Malpighi (Bologna) e hanno seguito la Dichiarazione di Helsinki sulla ricerca clinica internazionale che coinvolge esseri umani. Tutti i soggetti hanno dato il loro consenso informato scritto allo studio.
Attività Alpha-GAL L'attività Alpha-GAL è stata testata in 39 pazienti; i rimanenti 13 pazienti hanno eseguito solo l'analisi genetica poiché l'attività alfa-GAL è stata ritenuta una priorità non diagnostica poiché i pazienti appartengono a una famiglia con una mutazione FD. Inoltre, questo test è stato eseguito in diversi laboratori con diversi valori normativi. Per ottenere un valore uniforme tra i diversi pazienti, l'attività alfa-GAL è stata normalizzata al valore di cut-off inferiore (cioè il 100% era il valore di cut-off più basso; <100% corrisponde a un valore anormale e> 100% a un valore normale valore; quando il valore dell'attività alfa-GAL era 0, il valore normalizzato era 0%).
Esame clinico e test di laboratorio Tutti i pazienti hanno eseguito un esame neurologico. Il dolore è stato valutato per mezzo di una scala analogica visiva (VAS), scala che indicava il livello del dolore su una scala non tratteggiata di 100 mm che riportava ad una estremità "nessun dolore" e all'altro "peggior dolore immaginabile" [20] . In tutti i pazienti sono stati eseguiti studi conduttivi standard del motore (nervo tibiale bilateralmente) e sensoriali antidromici (nervatura surale bilaterale). La funzione renale è stata valutata mediante la velocità di filtrazione glomerulare (GFR) e considerata normale con GFR ≥60 ml / min / 1,73 m2 [21]. La cardiomiopatia è stata diagnosticata in presenza di fibrosi cardiaca e ipertrofia ventricolare sinistra. Il coinvolgimento oculare era caratterizzato da cambiamenti corneali ("cornea verticillata") o tortuosità della retina [3].
Biopsia della pelle Le biopsie del punch da tre mm sono state prelevate da siti prossimali (coscia: 15 cm sopra la rotula) e distali (gamba: 10 cm sopra il malleolo laterale). Non siamo stati in grado di prelevare campioni di pelle dalla coscia in 6 pazienti a causa del rifiuto del paziente. Secondo le procedure precedentemente pubblicate [22] i campioni di pelle sono stati immediatamente fissati nel fissativo freddo di Zamboni e conservati a 4 ° C durante la notte.
Depositi Gb3. Sono state ottenute cinquanta sezioni di micron usando un microtomo di congelamento a scorrimento (HM550, Thermo Scientific, Walthan, MA, USA) per valutare i depositi di Gb3. Di solito sono state analizzate 3 sezioni flottanti per ogni campione di pelle. Sono stati immunocolorati durante la notte con un pannello di anticorpi primari incluso topo monoclonale anti-Gb3 (1: 1000, sostanze chimiche TCI, Portland, Oregon, USA, codice A2506), prodotto del gene della proteina marcatore neuronale del coniglio 9.5 (1: 1000 ; AbD Serotec, Raleigh, NC, USA, n. Di riferimento 7863-0504) e coniglio policlonale anti-collagene IV (1: 500; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA; numero di catalogo NB120-6586). Le sezioni sono state quindi lavate e sono stati aggiunti anticorpi secondari per un'incubazione durante la notte. Come anticorpi secondari, un anti-coniglio Alexa Fluor (R) 488 (1: 400, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA, numero 711-545-152) o coloranti di topo cianina fluorofori 3.18 (1: 800; Sono stati usati Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA, numero 715-165-150). ULEX europaeus (1: 100; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA; numero di serie B-1065), una lectina legante biotinilata dell'endotelio, etichettata con fluoroforo colorante cianina 5.18 accoppiato con streptavidina (1: 400; Jackson ImmunoResearch; cat. 016-170-084) è stato utilizzato per mostrare l'endotelio. Le sezioni sono state visualizzate e analizzate con una microscopia confocale Nikon (Eclipse Ti A1). Ogni immagine è stata raccolta in fotogrammi successivi con incrementi di 1-2 μm su un piano Z-stack alle lunghezze d'onda appropriate per gli anticorpi secondari con un obiettivo apocromatico di piano x40 o x60 e successivamente proiettata per ottenere un'immagine digitale tridimensionale da un sistema computerizzato . Le impostazioni del microscopio sono state mantenute uguali per tutti i casi analizzati. L'analisi è stata effettuata in modo cieco da due autori con esperienza nell'analisi immunoflorescente (DV e IA). Il totale accordo sulla colorazione Gb3 è stato raggiunto dai due analizzatori in tutti i casi senza alcuna discordanza o classificazione incerta (cioè colorazione positiva o negativa in ciascun campione di pelle analizzato). La colorazione Gb3 è stata valutata in ciascun sito cutaneo come percentuale di strutture cutanee che mostrano una colorazione positiva ad alto ingrandimento (x40).
Innervazione della pelle Ulteriori sezioni da 50 μm dello stesso campione di pelle sono state ottenute durante la sessione di microtomo a scorrimento congelato. Tre sezioni flottanti sono state incubate durante la notte con un pannello di anticorpi primari, compreso il prodotto del gene della proteina marcatore neuronale del coniglio 9.5 (1: 1000; AbD Serotec, Raleigh, NC, USA, n. Di riferimento 7863-0504) e il collagene IV di topo(ColIV, 1: 800, Chemicon, Temecula, CA, USA, codice MAB1910) per definire l'epidermide di divisione della membrana basale dal derma. Le sezioni sono state quindi lavate e anticorpi secondari, etichettati con topo Alexa Fluor (R) 488 (1: 400, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA, n. Di cat. 715-545-150) e fluorochores di colorante di cianina di coniglio 3.18 (1 : 800, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA, numero 711-165-152) sono stati aggiunti per un'incubazione durante la notte. La densità delle fibre del nervo epidermico (ENF: numero di fibre non mieliniche per millimetro lineare dell'epidermide) è stata calcolata considerando una singola fibra del nervo epidermico contrassegnata da PGP 9.5 che attraversa la giunzione dermo-epidermica.
analisi statistica Abbiamo eseguito analisi statistiche utilizzando SPSS 15.0 per Windows. Sono stati usati test parametrici come il test di Kolmogorov-Smirnov ha mostrato che le variabili erano normalmente distribuite. Il test t di Student spaiato è stato utilizzato per confrontare i dati clinici e demografici tra: 1) pazienti FD vs controlli o pazienti con SFN; 2) Sottogruppi di FD (mutazioni di GLA classiche vs non classiche, maschi vs femmine, carico di Gb3 su pelle alta vs bassa; ERT vs senza ERT). La correlazione lineare con il test di Pearson è stata utilizzata per correlare i depositi cutanei di Gb3 con parametri clinici o punteggi di innervazione. p <0,05 è stato considerato significativo.
RISULTATI
Dati clinici L'esame neurologico era essenzialmente normale nei pazienti con FD ad eccezione di 2 pazienti maschi che mostravano perdita sensoriale tattile distale con distribuzione a "calze". Il dolore è stato segnalato da 21 pazienti con FD, più da parte dei maschi (72%, valore medio VAS 50 ± 20) che da femmine (54%, valore VAS 40 ± 20). Il dolore era più frequente nei pazienti con mutazioni classiche (66% vs 50%). Sintomi autonomi sono stati riportati da 22 pazienti e comprendevano principalmente perdita di sudorazione del palmo e della suola (19 pazienti) e dismotilità gastrointestinale con nausea, gonfiore, crampi addominali o diarrea (6) principalmente nel gruppo di mutazioni classiche (53% vs 25%). Quindici pazienti, principalmente quelli con mutazioni non classiche (35% vs 20%) avevano cardiomiopatia. Dieci pazienti (7 con classici e 3 con mutazioni non classiche) hanno mostrato angiokeratomi dell'inguine e dell'ombelico. Tre pazienti hanno mostrato insufficienza renale con diminuzione della GFR (Tabella 1) e 19 pazienti, principalmente quelli con mutazioni classiche (50% vs 20%), erano in terapia enzimatica sostitutiva (ERT). Gli studi di conduzione motoria e sensoriale erano normali in tutti i pazienti escluso un coinvolgimento periferico delle fibre nervose di grandi dimensioni anche in pazienti con insufficienza renale.
Depositi Gb3. Depositi anormali sono stati trovati in tutti i pazienti con mutazioni classiche, mentre tutti i pazienti con mutazioni non classiche erano negativi. I pazienti FD positivi per i depositi hanno mostrato una giovane età significativa rispetto ai pazienti negativi (Tabella 3). Non è stata trovata una chiara differenza nell'attività alfa-GAL sebbene questo valore non fosse disponibile in 13 pazienti (3 con classici e 10 con mutazioni non classiche) rendendo difficile il confronto tra questi due sottogruppi di FD.
Depositi di cute Gb3 sono stati trovati nelle pareti dei vasi sanguigni e nelle cellule endoteliali, tubuli della ghiandola sudoripare, muscolo perineurico, muscolo pilorum degli arretrati e cellule dermiche ma mai all'interno degli assoni (Fig 1). Depositi anomali si sono riscontrati principalmente nei maschi le cui strutture / cellule cutanee erano tutte colpite, mentre le femmine mostravano depositi anormali in tutti i vasi sanguigni analizzati, ma nel 95% delle cellule pilorum degli arretrati muscolari, nell'82% delle cellule perineuriali e nel 47% dei tubuli della ghiandola sudoripare. Gb3 non sono stati trovati nelle cellule dermiche delle femmine. Non sono state riscontrate differenze tra la coscia e la gamba per quanto riguarda la positività dei campioni cutanei e la quantità di depositi di Gb3, che non erano correlati con l'età, l'attività alfa-GAL o l'innervazione cutanea. Tuttavia, i pazienti con depositi Gb3 più elevati (100% degli annessi cutanei interessati) hanno mostrato una scala VAS più elevata sebbene non significativa (37 ± 21 vs 28 ± 20; p = 0,3) e sintomi autonomici (67% vs 48%) rispetto ai pazienti con depositi inferiori (62 ± 16% degli annessi della pelle interessati). I pazienti su ERT hanno mostrato un carico Gb3 più alto rispetto ai pazienti senza ERT (94 ± 10% vs 64 ± 20%, p <0,01) ma questo risultato potrebbe essere dovuto ad un numero elevato di pazienti maschi che mostrano depositi Gb3 diffusi (10 su ERT vs 2 senza ERT).
Innervazione epidermica. Le ENF erano diminuite nei pazienti con FD sia nella gamba (Fig. 2) che nella coscia. La diminuzione è stata riscontrata principalmente nei maschi (4 ± 3 e 8 ± 5, gamba e coscia rispettivamente) rispetto alle femmine (8 ± 4 e 13 ± 6), ma solo la differenza di coscia era significativa (p <0,05). I pazienti con mutazioni classiche hanno mostrato ENF più bassi rispetto ai pazienti con mutazioni non classiche sia nella gamba che nella coscia (Tabella 3). Inoltre, la SFN è stata riscontrata più frequentemente nei pazienti FD con mutazioni classiche (94% vs 70%). I pazienti con ERT hanno mostrato ENF inferiori sia nella gamba (p <0,05) che nella coscia (p = 0,06) rispetto ai pazienti senza trattamento, ma la differenza era probabilmente dovuta alla prevalenza dei maschi nel gruppo ERT.
Discussione Le principali conclusioni del nostro studio son: 1) i depositi di Gb3 cutanei sono specifici per i pazienti con FD con mutazioni classiche di GLA; e 2) i depositi di Gb3 sono stati associati ad innervazione della pelle inferiore ma non sono stati trovati all'interno degli assoni, suggerendo un danno indiretto sulla innervazione delle piccole fibre periferiche. La diagnosi di FD è difficile a causa dell'insorgenza non specifica dei sintomi. I depositi anomali di cute Gb3 sono stati studiati con tecniche complesse e costose che implicano l'uso della microscopia elettronica [13], sebbene un recente studio descriva una semplice tecnica di immunofluorescenza per rivelare depositi di Gb3 in pazienti con FD [16]. Abbiamo dimostrato che questa tecnica ha mostrato una promettente specificità nell'identificazione dei pazienti con FD poiché i depositi cutanei di Gb3 erano assenti nei controlli sani e nei pazienti con SFN con una causa specifica. Inoltre, i nostri dati hanno dimostrato che la colorazione della pelle Gb3 era associata a mutazioni classiche di GLA, mentre i pazienti con FD con varianti FD a insorgenza tardiva o con polimorfismi GLA non mostravano depositi di Gb3 anormali. Questi dati potrebbero essere spiegati dall'associazione tra le mutazioni classiche GLA e un'attività alfa-GAL inferiore con un effetto dannoso sul sistema nervoso periferico, mentre le varianti FD a insorgenza tardiva sono più spesso associate all'attività alfa-GAL normale, un effetto benigno sul sistema nervoso periferico e un coinvolgimento cardiaco prevalente [23-25]. Come riportato in precedenza, i nostri dati non ci hanno permesso di valutare in modo affidabile l'effetto dell'ERT sui depositi cutanei di Gb3 a causa di un diverso numero di pazienti maschi nei pazienti con o senza ERT, ma anche a causa di un'ampia variabilità di questo trattamento che va da 1 a 156 mesi (Tabella 1). Per raggiungere questo obiettivo specifico è necessario uno studio mirato prima e dopo il trattamento ERT in pazienti con età e sesso. SFN è un reperto tipico in FD [16,20,22] ed è responsabile del dolore neuropatico lamentato da questi pazienti [26]. Il meccanismo che induce il danno neuropatico è scarsamente compreso. I nostri dati hanno mostrato che i pazienti con SFN caratterizzati da una mutazione classica, ma è più sporadica nei pazienti con mutazioni non classiche. Questo risultato probabilmente riflette la maggiore incidenza di dolore e sintomi autonomici in pazienti con mutazioni classiche di FD e depositi cutanei di Gb3 che suggeriscono il coinvolgimento di questi depositi anormali nella patogenesi del danno alle piccole fibre. Infatti, la biopsia del nervo nei topi Fabry ha mostrato un accumulo anormale di vescicole di elettrodensità, probabilmente Gb3, all'interno di un gruppo di assoni non mielinizzati, che può essere responsabile di un danno diretto ai neuroni a fibre piccole [17]. Al contrario, la patologia nervosa nei pazienti con FD ha rivelato abbondanti depositi di Gb3 nelle cellule del muscolo perineurico, endoteliale e liscio, ma non all'interno degli assoni periferici suggerendo un effetto indiretto dei depositi di Gb3 sul danno dei nervi periferici dall'ostruzione dei vasi nervorici con successiva ischemia dei nervi periferici [18- 20]. Un possibile meccanismo alternativo indiretto potrebbe essere correlato ad anomalie nei gangli spinali indotte da depositi di Gb3 nei neuroni citoplasmatici [27,28]. I nostri dati sono in linea con queste conclusioni poiché non abbiamo rivelato depositi di Gb3 negli assoni della pelle, che sono stati trovati principalmente nelle pareti dei vasi sanguigni, nei condotti della ghiandola sudoripare o nelle cellule muscolari del muscolo pilorum. Questi risultati hanno supportato un danno indiretto di Gb3 sulle piccole fibre nervose della pelle. Inoltre, il valore inferiore dell'ENF della gamba rispetto alla coscia indipendentemente da una simile deposizione di Gb3 potrebbe suggerire una disfunzione dipendente dalla lunghezza come il sottostante meccanismo patogenetico che interessa le piccole fibre nervose. Tuttavia, l'espressione anormale dei canali ionici nei nocicettori periferici potrebbe essere coinvolta nel dolore neuropatico nel modello murino di FD contribuendo anche al loro danno strutturale, sebbene il meccanismo che induce queste anomalie non sia completamente compreso [29,30]. Infine, l'ampia gamma di variabilità fenotipica intrafamiliare relativa alla gravità della malattia ma anche agli organi bersaglio colpiti in pazienti con la stessa mutazione GLA [31] dovrebbe anche essere considerata l'analisi della neuropatia periferica nella FD. Il nostro studio ha le seguenti limitazioni: 1) l'attività alfa-GAL era carente in diversi pazienti che ci impedivano di stabilire una correlazione affidabile con ERT, innervazione cutanea o depositi di Gb3. A tal fine, sarebbe utile uno studio aggiuntivo che coinvolga un'ampia coorte di pazienti; 2) abbiamo analizzato pochi pazienti maschi con mutazioni non classiche. Un'analisi di questi pazienti sarà utile in futuro per confermare i nostri dati attuali; 3) inoltre, la quantificazione dei depositi di Gb3 mediante un'indagine ultrastrutturale può aumentare l'accuratezza di questa analisi.